液相色譜技術在食品分析中的作用

杭州天釗科技有限公司

1．前言

當代分析儀器發展的方向是高速，高靈敏度，高度，自動化和省力。在色譜法領域中，二十世紀60年代后半期，氣相色譜法理論的應用使柱色譜法得到了顯著發展，而柱色譜中開發的技術和方法又被薄層色譜法和液相色譜法所采有，從而使色譜法的功能大大提高，應用領域日益擴大。為了把這些現代色譜法和過去的方法相區別，把它們稱為色譜法。色譜法的建立，使色譜法在分析化學中的地位得到了提高。如今，色譜法在分析組成復雜的物質和多組分混合物時，是極為重要的分析方法。應用色譜法的目的是進行定量分析和單個分離出純物質。實際上，可根據分析目的，采用氣相色譜法、液相色譜法和薄層譜法中的一種或相互聯用之。液相色譜法和薄層色譜法中，所有可溶于流動相的物質均可作為分析對象。由于液相色譜在、簡便、快速方面倍受分析工作者推崇。使用較為廣泛，而薄層色譜則因分析時間較長，定量度覺差而作為液相色普預實驗方法^[1]。

液相色譜法（HPLC）是20世紀60年代發展起來的一種新型分析、分離技術。它是在經典液相色譜法的基礎上，引入氣相色譜法的理論和技術，以高壓輸送流動相，采用固定相及高靈敏度檢測器發展而成的現代液相色譜分析方法?，F代HPLC采用了小口徑柱（約1～3mm）和極細小的色譜填料（粒徑 <5μm），用高壓輸液泵使溶劑以高流速（1～10cm/s）通過色譜柱，分離速度比經典柱色譜法快100～1000倍，分離效率已接近毛細管柱氣相色譜法。因此， HPLC具有高壓、高速、、高靈敏度四大特點。HPLC與GC比較，雖然需要解決延長使用壽命的問題，但專家們普遍認為在眾多分析領域中HPLC比GC 更加實用。HPLC能夠分析受到熱穩定性和揮發性限制的化合物，而用GC分析這些化合物時則必須借助其衍生物。由于HPLC具有高分辨率、高靈敏度、速度快、色譜柱可反復利用、流出組分易收集等優點，所以被廣泛應用到生物化學、食品分析、醫藥研究、環境分析、無機分析等領域^[2]。

2．HPLC在糖類分析中的應用

糖是由碳、氫、氧3種元素組成的有機化合物，亦稱碳水化合物，根據其分子結構分為單糖、雙糖、低聚糖和多糖。食品分析工作者對糖分析方法的要求是既要適用于簡單食品，又要適用于復雜加工的食品，而且測定要準確、迅速、可靠。HPLC法測定糖具有明顯的優勢，并得到了廣泛的應用。糖的HPLC測定法主要有兩類。一類采用陽離子交換劑或者凝膠柱，以水、醋酸鈣溶液或稀酸等作為流動相。第二類是使用化學鍵合固定相，流動相為乙腈－水。

2.1 低分子糖的分析

低分子糖的分析，是指單糖到四糖的分析，食品分析專家要求能準確地測定部分或全部果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖。果糖、葡萄糖、蔗糖的分析可以提供蔗糖轉化的程度及轉化糖在產品中的含量;乳糖常作為脫脂奶粉等乳制品的一個主要指標;蔗糖則是zui常見的食品成分，這些都是HPLC分析食品中低分子糖的典型例子。用氨基鍵合相硅膠柱進行低分子糖的分析時，其典型的色譜條件是:柱長15～25cm，流動相為乙腈溶液（乙腈20～80%），檢測用示差折光檢測器（RID），進樣量通常為10～100μL，分析時間一般在20min以內^[3]。

2.2 低聚糖的分析

低聚糖的分析與上述低分子糖的分析極為相似，同樣可用氨基健合柱，但是流動相中水的比例要增加到40～60%，分析時間較長，大約需要30min。近來國內已有不少文獻報導。陳洪用HPLC法測定了飴糖中的低聚糖，發現飴糖中的低聚糖以麥芽糖為主，含量為25～39%，另外還含少量的葡萄糖、麥芽三糖和麥芽四糖，葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖的zui低檢出限在微克級。還有文獻報導了用液相色譜法分析蔗果低聚糖合成液和測定異麥芽低聚糖的組分^[3]。

2.3 多糖分析

多糖的分析，主要是用于分離純化及純度和分子量的測定。過去常用的測定方法有超速離心法、高壓電泳法、滲透壓法、粘度法和光散射法等。使用這些方法，操作麻煩，結果誤差很大。七十年代以后，由于耐高壓合成凝膠的出現，HPLC已可用于多糖純度和分子量的測定以及制備多糖的分離，這樣效果更好。

3．HPLC在氨基酸分析中的應用

測定氨基酸的標準方法是利用與茚三酮的顯色反應和離子交換色譜法分離。但是，Baky－er，E．于1976年用HPLC法分析氨基酸是利用衍生反應，使之轉化成具有強熒光衍生物檢測的濃度要比茚三酮反應低4－5個數量級。所以該法要比氣相色譜法要靈敏。HPLC法的操作條件是采用雙柱系統，柱1用梯度洗脫，柱2用恒定洗脫。熒光檢測DNS－氨基酸的激發波長為340nm，發射波長為510nm?？捎谜嗌V分離，在1毫升/分鐘流速下，柱溫65℃時可得到18種氨基酸的分離圖譜。也可用反相色譜分離，在1.5毫升/分鐘流速下，柱溫45℃可得到17種氨基酸的分離圖譜。檢測靈敏度和操作時間比標準方法都有很大提高。

在該方法研究的基礎上，有人先后把它用于分析糧食中的賴氨酸、蛋氨酸和色氨酸。J．J．Warthesen和P．L．Lramer1987年報道用HPLC法測定強化小麥粉中游離的賴氨酸。他們先從強化的面粉或面包中提取游離賴氨酸，用三氯醋酸沉淀蛋白質，離心后取上清液用0.1M硼酸緩沖液調PH至9.0，zui后定容到一定量。接著進行丹酰反應，讓賴氨酸提取液與氯化丹酰丙酮液于40℃避光條件下反應生成二丹酰賴氨酸衍生物。二丹酰賴氨酸衍生物通過十八烷基鍵合相柱，以乙腈/0.01MNa₂HPO₄（2：5）為流動相，在1.5毫升/分鐘流速下于8分鐘后分離出來，用紫外檢測器254nm外測。W．R．Peterson等人以大豆、酪蛋白、面筋、玉米為例，提出用HPLC法測定食品蛋白質中總賴氨酸和有效賴氨酸的分析方法。關于賴氨酸的測定方法與前者基本相同，只是增加一個用6.0NHCL水解的步驟，并把1.0毫克分子氯化丹酰丙酮液濃度提高到150毫克分子。在有效賴氨酸（具有游離ε－氨基的賴氨酸，若ε－氨基發生變化，會使賴氨酸失去營養強性）的測定中，又用HPLC法與氟代二硝基苯分光光度法進行了比較，其分析結果沒明顯差異。而且HPLC還比后者少了一個樣品凈化過程。色譜分離ε－二硝基苯賴氨基仍用十八烷基鍵同相柱，乙腈/0.01M醋酸緩沖液（20：80）（PH4.0）為流動相，于紫外可見光檢測器436nm處測定^[4]。

分析強化食品中游離蛋氨酸的HPLC法是Okeefe．L．L．和Warthesen．J．J．提出的，用1.0%甲醇從強化食品中提取DL-蛋氨酸，再用三氯醋酸沉淀蛋白質，經過濾用5NNAOH把濾液PH調至9.5，用水定容后取部分提取液進行丹酰反應。蛋氨酸的丹酰衍生物與其氯化物通過十八烷基鍵合相柱，乙腈/0.01MNa₂HPO₄（1：4 ，PH7.9）作流動相，在2毫升/分鐘流速下得到分離，于紫外檢測器254mn處測定。

用HPLC法測定食品中的色氨酸是利用分子本身的熒光，直接通過熒光計檢測，激發波長為283nm，發射波為343nm。用多孔硅膠柱分離，PH3.8的醋酸緩沖液作流動相，在2.5毫升/分鐘流速下獲得大麥水解物的色氨酸分離圖譜。檢測范圍是8×10^-9―270×10^-9克。在這項研究中，用含有麥芽糊精的6MNAOH水解蛋白質。麥芽糊精作抗氧劑，可提高某些酶（溶菌酶，胰凝乳朊酶）中色氨酸的回收，但對菜籽粉中色氨酸的回收沒影響。同時還證明蛋白質水解時間對色氨酸回收的影響。

４．HPLC在脂肪酸分析中的應用

谷物與飼料中的脂肪酸提取物可以它們的P-溴代苯酰甲酯衍生物形式用HPLC法分離測定。在溶于A/甲醇（2：1）液的類脂提取物中加入0.05N的氫氧化鉀/甲醇溶液，使堿與酸的克分子比例至少在9：1，再通過旋轉蒸發器濃縮樣品。皂化產物不必離析出來，類脂提取物在催化劑和苯酰甲基溴化物作用下，70－80℃、30分鐘之內可完成衍生反應。脂肪酸的P－溴代苯酰甲酯衍生物在十八烷基鍵合相柱上分離，甲醇/水（90：10）為流動相，以1毫升/分鐘流速，室溫條件下用紫外檢測器分析。該法說明利用衍生反應分析谷物和飼料中的游離脂肪酸或從甘油三酸脂衍生而來的脂肪酸都是有效的。但在等壓溶劑系統中不能把十六烷酸與油酸的衍生物分離開來，這也是與氣相色譜法相比較的不同之處。不過后來有人提出用梯度洗脫可以把上兩種脂肪酸分離開^[4]。

HPLC法還可以用示差折光檢測器分離硬質小麥及軟質小麥中含量不同的固醇軟脂酸鹽和固醇亞油酸鹽，在多孔硅膠柱上分離，己烷/氯紡（9：1）作流動相。

５．HPLC在維生素分析中的應用

維生素C是一種對人體十分重要但人體自身又不能合成的一類重要化合物。由于它具有抗壞血酸的生理功能，又名抗壞血酸，若嚴重缺乏會引起壞血病。維生素C還可參與體內氧化還原反應，具有解毒的作用。30 年代時，維生素C就被廣泛用于增加機體對傳染病的抵抗力，近年的研究表明維生素C可預防癌癥，并對肝炎、肝硬變有療效。它可促進膠原蛋白抗體的形成，因膠原蛋白能包圍癌細胞，維生素C具有抗癌作用，因它能參與神經介質、激素的生物合成，同時具有預防感冒、增強機體免疫力等功能^[5]。人體自身不能合成維生素C，必須從食物攝取。維生素C廣泛存在于新鮮水果和蔬菜中，測定方法一般有比色法、熒光分光光度法、化學滴定法等。由于上述方法操作煩瑣，近年來多采用液相色譜法測定^[6]。

對于維生素的分析，除了個別幾種維生素（維生素B6、B12和維生素H等）必須采用微生物法進行測定外，大多數維生素均可采用液相色譜法進行分析。水溶性維生素（B1、B2、C）的測定，將樣品用酸消化后，用酶分解蛋白質，然后用溶劑提取出維生素，而脂溶性維生素（A、K、E）的測定則將食品進行皂化處理后，提取不皂化物，然后再從不皂化物中將維生素萃取出來，預處理后的兩類維生素，通過液相色譜－紫外/可見檢測器在各自所固有的波長條件下進行定量測定。液相色譜法根據不同的要求，所選擇的固定相、流動相、流速、檢測器和檢測波長都不相同。多數方法采用熒光檢測器、電化學檢測器、紫外檢測器或在檢測中變換檢測波長。李學梅測定保健食品中維生素C時，選用的色譜條件為EclipseXDB－C18 416mm×250mm 5μm柱、C18416mm×20mm 5μm預柱，流動相為甲醇：0102mol/L^[2]。

6．HPLC在其他物質分析中的應用

6.1 HPLC在酸奶研究中的應用

隨著現代分析手段的不斷更新，越來越多高靈敏度、高準確度的先進分析技術和方法被用于酸奶的分析檢驗。由于液相色譜（HPLC）具有快速、方便、分辨率高、分離效果好、重現性好等優點，可將其用于檢測酸奶中富含的糖、脂、氨基酸、維生素等營養物質。原理是樣品先經預處理后，進行液相色譜分析，HP柱用粒徑為5～10μm的全多孔微粒擔體作載體，將洗脫劑（流動相）以高壓泵注入柱內，形成顯著的壓力降，樣品組分迅速連續不斷的在兩相間進行反復多次平衡分配，以達到分離的目的，各組分流出順序依其組分對兩相間的相對親和性。分離后的組分通過鑒定器產生訊號，經放大后在記錄儀上繪出色譜峰^[7]。

6.2 HPLC法測定紅葡萄酒中的白藜蘆醇

液相色譜法測定紅葡萄酒中白藜蘆醇及其甙的順、反異構體，操作簡單，精密度高，重復性好，可用于葡萄酒中白藜蘆醇4種異構體的測定。*，適量飲用紅葡萄酒對健康極為有益白藜蘆醇（resveratrol，簡稱RV）是紅葡萄酒中發揮保護作用的主要功能因子。白藜蘆醇的化學名為3，4’，5-三羥基二乙烯，在自然狀態下，其3位羥基上的氫原子被一個葡萄糖分子取代形成了白藜蘆醇甙（piceid，簡稱PD）。已有報道證實白藜蘆醇具有抗炎、抗菌、抗氧化、調節脂代謝、抗凝血、調節雌激素作用及抗腫瘤等多種生物活性，因此葡萄酒（汁）中白藜蘆醇含量的高低自然成為影響其保健功效的因素之一。

　　采用液相色譜法（HPLC）測定白藜蘆醇含量已有一些報道[。用液相色譜法測定水解前后順、反式白藜蘆醇含量的變化,從而計算出葡萄酒中白藜蘆醇的4種異構體的含量。色譜柱為SymmetryC18柱（319 mm i.d.×150 mm），流動相為乙醇-0.05%乙酸水溶液（體積比為23∶77），紫外檢測波長為306nm。其特點在于：采用陽光照射將白藜蘆醇及其甙的反式異構體部分轉化成順式異構體;利用β-2葡萄糖苷酶將順式及反式白藜蘆醇甙中的β-2葡萄糖苷鍵水解成為相應的白藜蘆醇異構體，從而解決了因葡萄酒中白藜蘆醇甙峰與其他組分峰重疊而不能被直接測定的問題;通過測定酶水解前后葡萄酒（汁）中順式、反式白藜蘆醇含量的變化，計算出葡萄酒（汁）中白藜蘆醇及其甙的順、反異構體的含量^[8]。

6.3 HPLC法分析羅漢果中主要皂甙成分的研究

羅漢果葫蘆科羅漢果屬多年生草質藤本植物的成熟果實，是我國傳統的藥用植物，臨床上可用于治療高血壓、肺結核、哮喘、胃炎、百日咳、急慢性氣管炎和急慢性扁桃腺炎等疾病。羅漢果的主要活性成分是葫蘆素烷三萜類皂甙，關于羅漢果皂甙的分析，目前普遍應用的是香草醛－硫酸比色法和香草醛－高氯酸比色法測定總皂甙含量^[9]，但分光光度法的穩定性及專屬性差。H．C．Makapugay等建立的液相分析方法，僅能分析羅漢果甙V，不能分離分析其他皂甙組。張云竹等^[10]建立一種快速的高壓液相分析方法，對羅漢果中的主要皂甙成分進行測定。以C18柱為色譜柱，采用反相液相法分離分析羅漢果皂甙。結果建立了羅漢果皂甙的HPLC分析條件，其色譜條件為：流動相23%的乙腈水溶液；流速1ml/min；檢測波長210nm；柱溫為室溫；靈敏度0.04AUFS。采用上述的液相分析方法分析四種羅漢果皂甙的含量，發現該方法簡便、快速、準確、線性范圍在0.5～13.75μg之間，且線性關系良好（R≥0.99），加標回收率高（94.46%～105.05%），精密度良好（RSD=1.40%～3.31%）。因此HPLC方法可用于分析羅漢果及其制品中的羅漢果皂甙含量。

6.4 HPLC法對N－亞硝胺的測定

N-亞硝胺可誘發肝癌、結腸癌等。某些 N-亞硝胺化合物，如 N-亞硝基二甲胺、N-亞硝基二乙胺、N-亞硝基四氫吡咯等也是一類致癌物質。過去采用氣相色譜法測定食物中揮發性亞硝胺，其中僅色譜測定一步便需耗時1h之多，而采用液相色譜法則只需要13min。

6.5 HPLC法對芳香胺的測定

芳香胺在合成色素中應較多。當食品中色素添加過量時，對人體可造成害。因此芳香胺的分離測定在食品安全上也很重要。各種二胺異構體的分離測定可采用PermaphaseETH譜柱，移動相同甲醇－環戊烷（5∶95）。2，6-甲苯胺、2，3-二甲苯胺及苯胺的分離可用Durpakcarbowax400/Corasil，淋洗液為異丙醇－已烷（10∶90）。硝基苯胺異構體的分離用Vydac吸附劑，用已烷－A（1∶1）作淋洗液。按鄰、對間位順序沖出，分離時間為3min~18min^[11]。

6.6 HPLC法對黃曲霉毒素的測定

黃曲霉毒素是黃曲霉菌類所產生的代謝產物。各種發霉的食物如花生、大米、玉米等，都可能遭此種毒素污染。現已確定黃曲霉毒素有B1、B2、B2a、G1、G2、G2a、M1、M2等 8種結構的類似物。這些毒素毒性*，在實驗動物身上幾個微克便能誘致肝癌的發生。液相色譜法分離測定黃曲霉毒素，可采用Sli-X-Ⅱ，室溫下A－異辛烷淋洗，B1、B2、G1、G2依次沖出，分析時間約7min。如PermaphaseETH，2-丙醇-水（3∶97）則以G1、B2、G2、B1次序沖出。由于黃曲霉毒素在254納米吸收很強，因此可檢測出10－9。此外，此毒素還能產生熒光，應用熒光檢測器則檢出靈敏度可更高。

7．結語

液相色譜法只要求樣品能制成溶液，不受樣品揮發性的限制，流動相可選擇的范圍寬，固定相的種類繁多，因而可以分離熱不穩定和非揮發性的離解的和非離解的以及各種分子量范圍的物質。與試樣預處理技術相配合，HPLC所達到的高分辨率和高靈敏度，使分離和同時測定性質上十分相近的物質成為可能，能夠分離復雜相體中的微量成分。隨著固定相的發展，有可能在充分保持生化物質活性的條件下完成其分離。由于高壓輸液泵的使用，相對于經典液相色譜，其分析時間大大縮短，當輸液壓力增加時，流動相流速會加快，完成一個樣品的分析時間僅需幾分鐘到幾十分鐘。因此，液相色譜技術在食品分析領域具有巨大的現實意義。